超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基（O₂^·-）的酶。本项目依据SOD抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O₂^·-，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而 SOD可清除O₂^·-，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。

1 试剂

（1）0.05 mol/L 磷酸缓冲液（PBS，pH 7.8）

（2）14.5 mM甲硫氨酸（Met）溶液

（3）3 mM EDTA-Na₂溶液

（4）60 μM核黄素溶液

（5）2.25 mM氮蓝四唑（NBT）溶液

2 实验方法

2.1 样品前处理

称取0.2 g样品置于预冷的研钵中，分三次加入6 ml（2 ml、2 ml、2 ml）预冷的磷酸缓冲液（pH 7.8），在冰浴上研磨成匀浆，转入10 ml离心管中，低温12000 r/min离心20min，上清夜即为酶粗提液。

2.2 测定方法

取试管3支，1支为测定管，另外2支为对照管，按下表依次加入各溶液：

各管混匀后，将对照管1用锡箔纸包好置于暗处，其他各管于4000 Lx 光照下准确反应20 min。反应结束后，以对照管1作为空白调零，分别测定其他各管在560 nm下的吸光度。

注：可提前配置反应混合液（以60个样品为例）：分别取Met溶液162 ml，EDTA-Na₂溶液6 ml，NBT溶液6 ml，混合后充分摇匀。取2.9 ml混合液+0.02 ml酶液+0.1 ml核黄素。

2.3 计算公式

已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活性单位（U），按下式计算活性。

其中：

SOD总活性以酶单位每克鲜重表示（U/g·FW）；

SOD比活力以酶单位·每毫克蛋白表示；

A_ck为照光对照管的吸光度；

A_E为样品管的吸光度；

V_t为提取酶液总体积（ml）；

V_s为测定时酶液用量（ml）；

W为样品鲜重（g）；

蛋白质含量单位为mg/g。